Диагностика сальмонеллеза птиц с использованием ПЦР-наборов разных производителей

Серьезной проблемой в сельском хозяйстве, несущей экономический ущерб птицеводческим предприятиям, а также негативно влияющей на эпидемиологическую обстановку в РФ, являются общие для животных и людей инфекции. Среди бактериальных зоонозных инфекций ведущую роль занимает сальмонеллез, который часто диагностируется на территории Российской федерации.

Экономические потери при заболевании промышленной птицы сальмонеллезом связаны с падежом птицепоголовья, снижением яичной и мясной продуктивности, с необходимостью выбраковки птицы, вывода из оборота целых стад, ограничениями в реализации птицеводческой продукции.

Сальмонеллез вызывается бактериями вида Salmonella enterica, которые относятся к одному из 12 видов «приоритетных патогенных микроорганизмов», представляющих серьезную опасность для здравоохранения, входящих в список ВОЗ. Этот патогенный микроорганизм необходимо строго контролировать, так как появление устойчивых к антибиотикам серотипов может повлиять на здоровье человека.

Основной причиной заражения людей сальмонеллезом является употребление в пищу контаминированной сальмонеллами животноводческой и птицеводческой продукции, из чего можно заключить, что эпидемическая обстановка по острым кишечным инфекциям у людей во многом связана с эпизоотическим благополучием по сальмонеллезу животных и птицы.

В связи с этим главными задачами ветеринарных специалистов являются выполнение правил ветеринарно-санитарной безопасности животноводческой и птицеводческой продукции, проведение широкого комплекса профилактических мероприятий, направленных на защиту населения от болезней, общих для человека и животных.

Для промышленного птицеводства проблема своевременного выявления Salmonella enteritidis заключается в том, что это заболевание протекает бессимптомно. Диагностика данного заболевания включает в себя анализ эпизоотологической ситуации, клинической картины, патологоанатомических изменений, результатов бактериологических и серологических исследований как в период вывода и выращивания птицы, так и при выпуске готовой продукции.

В целях доказательства отсутствия возбудителя сальмонеллеза на птицефабриках осуществляют отбор проб в соответствии с планами мониторинга ветеринарной безопасности на соответствующий год.

Лабораторная диагностика по сальмонеллезу включает в себя бактериологические, серологические (кровекапельную реакцию непрямой гемагглютинации (ККРНГА), реакцию микроагглютинации (РМА), метод иммуноферментного анализа (ИФА) и молекулярно-биологический методыисследования (полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Международным эпизоотическим бюро (МЭБ) разработаны стандарты, определены лабораторные методы для диагностики болезней животных и птиц, такие как ИФА-диагностика и ПЦР-метод. Диагноз на сальмонеллез подтверждают при получении положительных результатов методом ИФА, методом ПЦР, положительных результатов в ККРНГА.

Метод ПЦР предназначен для прямого выявления и идентификации патогенных агентов практически для всех известных заболеваний, даже в тех случаях, когда другими способами (серологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление затрудненно. Преимуществами ПЦР-исследований являются прямое определение наличия возбудителей, высокая специфичность и чувствительность, универсальность процедуры выявления различных возбудителей, возможность диагностики латентных инфекций, высокая скорость получения результата анализа.

Цели работы — провести сравнительные исследования паталогического материала на наличие ДНК рода Salmonella spp. и видов Salmonella enteritidis (S. еnteritidis) и Salmonella typhimurium (S. typhimurium) с использованием трех наборов для выделения и выявления ДНК сальмонелл методом ПЦР, импортного (диагностическая тест-система BioChek — MP102 Salmonella) и отечественного (набор «ВетФактор» «ПЦР-САЛЬМОНЕЛЛЕЗ-ДИФ-ФАКТОР» и набор реагентов «Вектор Бест» для выявления ДНК Salmonella species) производства, определение возможности использования мембранных стекловолоконных материалов в виде карточек для отбора сухих проб патматериала для последующего проведения ПЦР.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили в 2024 году на базе ООО «Экспертная лаборатория» (Москва, Россия). В процессе выполнения исследований были использованы классические методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции согласно ГОСТ Р 57989.

От павших и убитых с диагностической целью кур несушек (в количестве 20 голов в возрасте 340 дней) в одном из хозяйств Южного федерального округа Российской Федерации автором совместно с представителем ветеринарной службы хозяйства были отобраны паренхиматозные органы целиком и (или) их фрагменты: доля печени с желчным пузырем, селезенка, трубчатая кость, измененные яичные фолликулы.

Из отобранного материала были составлены 4 сборные пробы.

Для проведения испытаний в лабораторию были отправлены замороженные пробы биоматериала и полученные от них высушенные отпечатки органов, отобранные с использованием отечественных карточек для получения сухих образцов биоматериала со стекловолоконной впитывающей мембраной (ООО «УниверсиТест», Россия). С целью получения отпечатков небольшие кусочки органов прикладывалив обозначенную кругом зону до видимого пропитывания носителя.

При приготовлении пулированных образцов допускали последовательное нанесение до 5отобранных проб тканей в одну круговую зону. Карточки высушивали в открытом виде при комнатной температуре (не менее часа). После высыхания карточки в закрытом виде были помещены в индивидуальный пластиковый пакет с осушителем и отправлены в лабораторию. Общее количество образцов патматериала в замороженном и высушенном виде на мембране составило 8.

Для выявления ДНК сальмонелл в замороженных и сухих пробах биоматериала методом ПЦР использовали три набора:

1.      Набор производства ООО «ВетФактор» (Россия): «ВетФактор» «ПЦР-САЛЬМОНЕЛЛЕЗ-ДИФ-ФАКТОР» — набор реагентов. Предназначен для выявления ДНК возбудителя сальмонеллеза (Salmonella spp., Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium) в биологическом материале (цельной крови, фекалиях, паренхиматозных органах и лимфатических узлах), а также в продуктах питания (в том числе яйцах кур и других птиц) и кормах животного и растительного происхождения, в культурах микроорганизмов, смывах с поверхностей методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

2.      Диагностическая тест-система производства «БиоЧек» (Biochek, Германия): BioChek — MP102 Salmonella. Набор многовидовой для выявления ДНК возбудителя сальмонеллеза (Salmonella spp., Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium) методом ПЦР в реальном времени.

3.      Набор реагентов производства «Вектор-Бест» (Россия) — для выявления ДНК Salmonella species с дифференциацией типов Salmonella typhimurium и Salmonella enteridis методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Выявление сальмонелл в исследуемых образцах проводили методом Real-Тime PCR согласно Методическим указаниям (МУ 1.3.2569-09), предназначенных для специалистов лабораторий, выполняющих работы с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) при исследовании материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I–IV групп патогенности.

Материал был подготовлен и исследован согласно инструкции к наборам реагентов.

Пробы сухих образцов биоматериала перед выделением нуклеиновой кислоты предварительно подготавливали:

а) отделяли стерильными ножницами один сегмент (в виде треугольника) из центра мишени мембраны с высушенным отпечатком органов птицы, стерильным пинцетом помещали сегмент в пробирку с 1 мл физраствора и выдерживали экспозицию 30 мин.;

Б) тщательно перемешивали раствор в вортекс-центрифуге (производитель Biosan («Биосан», Латвия).

Далее проводили исследование полученных образцов согласно инструкции к наборам реагентов. Полученные данные были обработаны на Bio-Rad ДНК-амплификаторе в реальном времени CFX96 Touch. При исследовании сухих проб делали три технических повтора на каждый набор. Воспроизводимость результатов каждого из трех наборов по результатам технических повторов составила 100%. Сходимость результатов всех трех наборов составила 100%.

Результаты и обсуждение

Результат исследования паталогического материала на наличие ДНК возбудителя болезни сальмонеллеза представлен в таблице 1.

При сравнении полученных результатов исследований парных образцов патматериала и высушенных отпечатков органов (при использовании наборов разных производителей) на наличие ДНК Salmonella spp. с дифференциацией типов S. Enteritidis и S. Typhimurium наблюдаются идентичные результаты.

Средний цикл выхода положительных образцов сухих проб на Salmonella spp. в наборе «ВекторБест» составил 34,75, на S. Typhimurium — 35,31. При параллельном исследовании патматериала, доставленного в лабораторию в замороженном виде, средний цикл на Salmonella spp. — 35,75, на S. Typhimurium — 35,76. При положительном контроле K+ ct 28,62.

Согласно инструкции анализируемый образец считался положительным, содержащим ДНК Salmonella species, если для данного образца значение сt по каналу ROX меньше или равно 40. Анализируемый образец считался положительным, содержащим ДНК Salmonella typhimurium, если для данного образца значение сt по каналу FAM меньше или равно 40. Анализируемый образец считался положительным, содержащим ДНК Salmonella enteridis, если для данного образца значение сt по каналу HEX меньше или равно 40.

При использовании набора реагентов «ВетФактор» средний цикл положительных сухих образцов на Salmonella spp. показал 28,57, на S. Typhimurium — 28,85. Данные среднего цикла исследования патматериала на Salmonella spp. — 28,07, на S. Typhimurium — 28,35. При положительном контроле K+ ct 24,42.

Импортный набор реагентов Biocheck показал следующие результаты: средний цикл положительных сухих образцов на Salmonella spp. — 33,78, на S. Typhimurium — 35,25. Данные исследования патматериала, доставленного в замороженном виде, показали средний цикл Salmonella spp. — 35,25, на S. Typhimurium — 37,12. При положительном контроле K+ ct 27,08.

Все положительные образцы были индицированы как положительные, все отрицательные— как отрицательные. Таким образом, специфичность и чувствительность наборов реагентов отечественного производства, как и импортного производства, составили 100%.

При анализе результатов наличия ДНК сальмонелл в отпечатках органов, полученных на используемых ПЦР-картах, позволил во всех случаях выявить искомый патоген. При этом хранение биоматериала в таком виде не требует заморозки, а также позволяет снизить объем занимаемого места в холодильном отделении и облегчить последующую утилизацию проб.

С точки зрения отправителя, данный способ пробоподготовки облегчает хранение и пересылку проб, так как после высушивания отпечатков на картах пробы сохраняют высокую стабильность и сохранность ДНК.

Выводы

Использование наборов для выявления ДНК возбудителя сальмонеллеза (Salmonella spp., Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium) методом ПЦР российского производства позволило получить достоверные результаты, которые сопоставимы с результатами, получаемыми при использовании импортных аналогов.

Достоверность проводимого ПЦР-исследования всех трех наборов подтверждалась выявлением положительного контроля.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наборы реагентов «Вектор-Бест» и «ВетФактор» позволяют выявлять Salmonella spp., обеспечивая высокую чувствительность и специфичность анализа, что особенно важно для российского рынка в условиях импортозамещения.

Данные, полученные в результате параллельных исследований замороженных и сухих проб биоматериала, указывают на возможность использования систем на основе впитывающих стекловолоконных карточек для отбора и доставки образцов в высушенном виде для проведения контроля мониторинга сальмонеллеза птиц методом ПЦР и получения достоверных результатов.

Об авторах

Анна Владимировна Рузина; научный сотрудник Лаборатория болезней птиц

a.ruzina@avivac.com; https://orcid.org/0000-0001-8161-1716

Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук, Рязанский пр-т, 24, корп. 1, Москва, 109428, Россия

УДК 619:577.29;579.842.14
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-46-50

Просмотров: 161