• Виктория

Анализ морфологии ооцит-кумулюсных комплексов Sus scrofa domesticus, подвергшихся воздействию низких и сверхнизких температур

В настоящее время одной из важнейших целей животноводства является сохранение генофонда особо ценных пород и особей. Реализация поставленной задачи осуществляется путем создания банков криоконсервированных репродуктивных клеток и эмбрионов животных. Однако выход донорских декриоконсервированных ооцитов с высокими качественными характеристиками, способными к созреванию, в отличие от эмбрионов, низкий (до 33%). Тем не менее женский генетический материал является важным составляющим в рамках сохранения генофонда и использования в инновационных клеточных репродуктивных технологиях для получения трансгенных или клонированных животных.

В технологиях хранения женских гамет используются методы экстра- или интрафолликулярной криоконсервации. Оптимизированным вариантом этого вида замораживания является витрификация, при которой образцы хранятся в жидком азоте (-196 оС) и сохраняют жизнеспособность после оттаивания. При витрификации происходит мгновенный переход из жидкого состояния в твердое с минимизацией кристаллизации за счет увеличения вязкости при охлаждении, что приводит к снижению повреждения внутриклеточных органелл.

Для модернизации протоколов замораживания ооцитов с целью исключения внутриклеточных повреждений применяются различные вещества, обладающие криопротекторными свойствами, подобно традиционному криопротектору — глицерину.

Одним из таких веществ является тетраполиэтиленгликолят титана в 10-кратном мольном избытке полиэтиленгликоля (TTPEG*10PEG), синтезированный в Институте органического синтеза им. И.Я. Постовского (УрО РАН, г. Екатеринбург, Россия). Данное вещество прозрачное, светло-желтого цвета, легко растворяется в воде и полиэтиленгликолях. При растворении TTPEG*10PEG в воде происходит быстрый обратимый гидролиз, возрастает вязкость раствора, формируется полимерный пространственный каркас с образованием прозрачного монолитного геля.

Хранение ооцита при воздействии низких и сверхнизких температур осуществляют в комплексе с окружающими его кумулюсными клетками. Соматические клетки в составе ооцит-кумулюсного комплекса, взаимодействуя с ооцитом, снабжают гамету важными биомолекулами, транспортируют их в цитозоль. С другой стороны, ооцит-секретируемые факторы роста (OSF) индуцируют пролиферацию соматических клеток фолликула.

Взаимодействие кумулюсных и половых клеток осуществляется через тесные межклеточные связи. Функциональное состояние данных соматических клеток оказывает влияние на качество гаметы, в связи с чем является важным маркером прогнозирования качества ооцита на любом этапе развития или в процессе низкотемпературного хранения и замораживания (оттаивания). Следуя вышесказанному, комплексное тестирование морфологии гаметы и окружающих ее клеток кумулюса при воздействии различных факторов, в частности низких и сверхнизких температур, представляет интерес для разработки оптимальных протоколов технологий хранения овариальных клеток.

Наиболее подходящими вариантами для оценки качества клеток являются гаметы от многоплодных сельскохозяйственных животных свиней, ввиду чего можно получить большое количество гамет из одного яичника. Кроме того, ооциты свиней содержат высокий уровень интрацеллюлярных липидных капель, препятствующих процессу замораживания, в связи с чем именно этот объект служит хорошей моделью для оценки качества гаметы.

Цель исследования — комплексный анализ морфологии половых и соматических клеток (кумулюс) овариальных фолликулов свиней после воздействия низких (краткосрочное хранение при температуре 5 оС) и сверхнизких температур (витрификация) при включении в протокол низкотемпературного хранения и витрификации TTPEG*10PEG.

Материалы и методы исследования

Исследования проводились на базе ВНИИГРЖ. Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из фрагментов яичников (ФЯ) свиней. Яичники от 6–8-месячных свиней породы ландрас получали post mortem на мясокомбинате ОАО «Тосненский». Яичники на стадии фолликулярного роста без видимых патологических изменений разделяли скальпелем на 6–8 фрагментов размером примерно 15 × 20 мм.

Для низкотемпературного хранения (5 оС) ФЯ помещали в фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (ФСБ, Россия) и хранили в холодильнике в течение 3 часов при 5 oС (контроль).

Опытные группы ооцитов содержали в ФСБ с добавлением TTPEG*10PEG в концентрации 2%. ОКК выделяли путем резекции из ФЯ для анализа морфологии и проницаемости мембран клеток.

Оценку проницаемости мембраны проводили путем окрашивания ооцит-кумулюсных комплексов в течение 25 минут в красителе лиссаминовый зеленый (ContaCare, Индия) при 24 оС по модифицированной методике A. Bartkova. Краситель проникает сквозь поврежденную мембрану клетки в цитоплазму и накапливается в цитозоле, следовательно, клетки с поврежденной мембраной окрашиваются в зеленый цвет, а клетки с целой мембраной остаются бесцветными.

ОКК ранжировали по группам:

  • 1. ОКК без окраски;
  • 2. ОКК с окраской менее 50% кумулюсных клеток, ооцит не окрашен;
  • 3. ОКК с окраской кумулюсных клеток более 50%, ооцит не окрашен;
  • 4. Окраска ооцита и кумулюсных клеток;
  • 5. Окраска только ооцита (рис. 1).  

Для витрификации гамет готовили криопротекторные агенты (КПА) на основе ФСБ с 20% фетальной бычьей сыворотки (ФБС): КПА-1 — 7,5% ЭГ + 7,5% ДМСО, затем в КПА-2 — 15% ЭГ, 15% ДМСО и 0,5 М сахарозы. В КПА-2 вносили TTPEG*10PEG в концентрации 2%. В отборе концентрации руководствовались рекомендациями разработчиков (Институт органического синтеза УрОРАН им. И.Я. Постовского. Экспонировали ФЯ в растворах КПА в соответствии с протоколом, описанным ранее, последовательно в течение 25 мин. и 15 мин. ФЯ в стерильных марлевых мешочках погружали в жидкий азот (-196 оС) для хранения — не менее чем на сутки. Образцы девитрифицировали поочередно: 1 мин. в растворе 80% ФСБ, 20% ФБС, 0,5 моль/л сахарозы, а затем 5 мин. в растворе: 80% ФСБ, 0,25 моль/л сахарозы.

После оттаивания ФЯ ооцит-кумулюсные комплексы выделяли резекцией фолликулов. Выделенные в ФСБ из ФЯ ооцит-кумулюсные комплексы оценивали по степени экспансии кумулюсных клеток и морфологии ооцитов. ОКК ранжировали по степени экспансии кумулюса: низкая степень экспансии — от 8 и более компактных слоев КК; средняя степень экспансии — неоднородный (компактный и рыхлый) кумулюс; высокая степень экспансии — более 8 рыхлых слоев КК.

К дегенерированным ооцитам относили гаметы с поврежденной или неравномерной по ширине зоной пеллюцида, гетерогенной, вакуолизированной, фрагментированной ооплазмой (рис. 2).

Для сравнения результатов экспериментов использовали критерий χ2 с помощью программы Statistica 6.0 (США). Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: р < 0,01, р < 0,05, р < 0,001; р < 0,005 для трех независимых экспериментов.

Результаты и обсуждение

Начальный этап серии экспериментов по оценке криозащитных эффектов TTPEG*10PEG — оценка проницаемости мембраны соматических и половых клеток, выделенных из нативных и экспонированных при низких температурах в течение 3 часов с TTPEG*10PEG (рис. 3). Анализ проницаемости стенок клеточной мембраны показал, что краткосрочное воздействие низких температур (5 оС) негативно отражается на проницаемости мембраны ооцитов, что выражается в снижении доли неокрашенных ОКК, не имеющих окраски лиссаминовым зеленым красителем (48% против 30% соответственно, р < 0,01).

Воздействие низких температур в течение 3 часов увеличило выход ооцитов с интенсивной окраской лиссаминовым зеленым в сравнении с группой нативных гамет с 6 до 23% в контрольной группе (р < 0,001) и до 17% в опытной группе (р = 0,005).

В целом представленные данные свидетельствуют о негативном влиянии низких температур хранения (5 оС). Тем не менее введение в фосфатно-солевой буфер TTPEG*10PEG не вызывало достоверного снижения уровня ОКК без окраски.

Наряду с проницаемостью клеточной мембраны важным показателем качества ОКК является наличие плотного кумулюса, окружающего ооцит. Кумулюсные клетки выполняют питательную функцию по отношению к гамете, снабжая ее необходимыми питательными веществами и регуляторными молекулами через щелевые контакты. Кроме того, они регулируют процессы ингибирования и реинициации мейоза в ооцитах, поэтому необходимы для роста и созревания ооцитов.

После экспозиции в течение 3 часов при температуре 5 оС с введением раствора TTPEG*10PEG выявлено достоверное снижение (р < 0,05) доли гамет с низкой экспансией кумулюсных клеток (до 18%) в сравнении с группой нативных гамет (35%), а также контрольной группы (30%) (рис. 4).

Уровень нативных ооцитов со средним уровнем экспансии клеток кумулюса значительно превышал уровни гамет контрольной (26% против 11% соответственно, р < 0,05) и опытной (26% против 10% соответственно, р < 0,005) групп.

Аналогично доля нативных ооцитов с высокой экспансией клеток кумулюса значительно превышала доли гамет контрольной (18% против 2% соответственно, р < 0,005) и опытной (18% против 3% соответственно, р < 0,005) групп.

Экспозиция гамет в течение 3 часов при 5 оС приводила к увеличению доли денудированных гамет контрольной и опытной групп до 57% и 69%, соответственно, в сравнении с долей нативных ооцитов 21% (р < 0,001).

Оценка качества гамет по морфологии представлена в таблице 1.

Внесение TTPEG*10PEG в контрольную среду для краткосрочного низкотемпературного хранения при температуре 5 оС в течение 3 часов обеспечило снижение доли дегенерированных гамет до 5% в сравнении с долей контрольных гамет 13% (р < 0,005).

Вышеописанные данные свидетельствуют о цитопротекторном эффекте TTPEG*10PEG, влияющем на качество кумулюсных и половых клеток свиней в условиях низкотемпературной обработки, представленных в методике настоящей публикации.

Известно, что TTPEG*10PEG в водной среде создает сетчатую структуру полимерных гидрогелей в виде плотной пленки, образуя гидрогелевую оболочку вокруг исследуемой структурной единицы, возможно, снижающую процесс кристаллообразования.

Учитывая позитивные эффекты TTPEG*10PEG на морфологические показатели ОКК в условиях обработки низкими температурами в следующей серии экспериментов, были проанализированы уровень экспансиии и доля дегенерированных клеток из ФЯ, подвергшихся витрификации с использованием в качестве добавки во второй криопротектор TTPEG*10PEG.

На рисунке 5 и в таблице 2 представлены результаты по оценке морфологии интраовариально витрифицированных соматических и половых клеток.

Минимальная доля ооцитов без кумулюса (21%) обнаружена в группе нативных гамет, что достоверно ниже доли денудированных ооцитов, интраовариально витрифицированных как без (65%, р < 0,001), так и с использованием раствора в TTPEG*10PEG в концентрации 2% (50%, р < 0,001). Кроме того, внесение TTPEG*10PEG в криопротектор снизило долю денудированных гамет на 15% в сравнении с контрольной группой (50% против 65% соответственно, р < 0,05).

В контрольной группе достоверно снизился уровень гамет со средней экспансией КК до 8% по сравнению с нативными ОКК 26% (р < 0,001).

После витрификации, вероятно, из-за быстрого снижения температуры, резко уменьшается доля гамет с высокой экспансией клеток кумулюса в сравнении с долей нативных клеток (18%) на 13% в контрольной и на 14% в опытной группах (р < 0,005). Последнее может быть вызвано ростом денудированных клеток в результате драматического разрыва ооцит-кумулюсных коммуникаций.

Обнаружены достоверные различия между долями нативных и витрифицированных в контрольных условиях гамет с признаками морфологической дегенерации (8% против 17% соответственно, р < 0,005).

Показано снижение доли дегенерированных гамет, витрифицированных в опытных условиях в сравнении с долей ооцитов, замороженных в контрольных условиях (8% против 17% соответственно, р < 0,005). При этом доля морфологически дегенерированных гамет опытной группы соответствовала уровню нативных ооцитов (8%).

Внесение TTPEG*10PEG в фосфатно-солевой буфер для экспозиции при температуре 5 оС в течение 3 часов оказывает криозащитный эффект на проницаемость клеточных мембран как кумулюсных клеток, так и ооцитов. Проявление данного свойства выразилось в тенденции к увеличению доли ооцит-кумулюсных комплексов без окраски лиссаминовым зеленым на 7%. Кроме того, воздействие TTPEG*10PEG не оказывает токсического воздействия на гаметы, что подтверждается снижением долей выделенных ооцитов с признаками морфологической дегенерации в условиях как низких, так и сверхнизких температур.

Выявленные показатели опытных клеток, по всей видимости, зависят от структурных особенностей глицерогеля, содержащего титан, поскольку глицерогель имеет свойство хорошо растворяться в воде с выделением содержащих титан структур. В организме титан может выполнять противомикробную функцию за счет уникального свойства при УФ-облучении, приводящего к образованию синглетного кислорода и супероксид-аниона, которые способны повреждать клеточные оксиданты.

Однако в свободном виде титан используется организмами редко, несколько чаще встречаются варианты металлопротеинов, в том числе содержащих титан [14]. В целом в организме больше используются формы растворимых гидроксидов в виде органических или минеральных комплексов.

Основываясь на вышесказанном, можно предположить, что при взаимодействии с фосфатно-солевым буферным раствором или криопротектором из глицерогеля образуются содержащие титан компоненты, которые оказывают непосредственное протекторное воздействие на содержимое клетки, проникая через поры клетки или же обволакивая оболочку клетки.

Выводы

В результате исследования проведен комплексный анализ морфологии ооцит-кумулюсных комплексов овариальных фолликулов свиней после воздействия низких и сверхнизких температур при введении TTPEG*10PEG в схему протокола.

Выявлены протекторный и криопротекторный эффекты тетраполиэтиленгликолята титана в 10-кратном мольном избытке полиэтиленгликоля на морфологические показатели соматических и половых клеток овариальных фолликулов свиней. Данные выражались в снижении уровней дегенерированных ооцитов, а также высоких показателях ОКК с низкой экспансией кумулюсных клеток.

Таким образом, результаты эксперимента могут быть использованы в технологии интраовариальной витрификации женских репродуктивных клеток на основе углубленного анализа воздействия TTPEG*10PEG на структурные компартменты ооплазмы гаметы.

Об авторах

Дарья Андреевна Старикова, научный сотрудник лаборатории биологии развития, кандидат биологических наук

live8avis@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5324-4090

Татьяна Ивановна Кузьмина; главный научный сотрудник лаборатории биологии развития, профессор, доктор биологических наук

prof.kouzmina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4218-6080

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московское шоссе, 55А, пос. Тярлево, Пушкин, Санкт-Петербург, 196625, Россия

УДК 636.4, 606, 602.42
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-139-144

Просмотров: 129


Источник: https://agrarnayanauka.ru/analiz-morfologii-ooczit-kumulyusnyh-kompleksov-sus-scrofa-domesticus-podvergshihsya-vozdejstviyu-nizkih-i-sverhnizkih-temperatur/

Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии
guest