Экспериментальное исследование острой токсичности внутримышечной формы специфического иммунобиостимулятора — трансфер-фактора

В последние годы активно внедряются схемы комплексной профилактики и лечения заболеваний различной этиологии, включающие использование иммуномодуляторов различного происхождения.

Многообещающим новым методом лечения и профилактики, хотя и недостаточно разработанным, является метод клеточной иммунотерапии, предусматривающий включение иммунокорректоров антигеннаправленного действия в используемые схемы, обладающих активностью фактора переноса («Трансфер-фактор») и цитотоксическими эффектами.

«Трансфер-фактор» (TF), или диализируемый экстракт лейкоцитов (DLE), используется для запуска механизмов специфической иммунной реактивности в организме животных посредством инъекции лейкоцитарного препарата, полученного из крови иммунизированных доноров. Он представляет собой гетерогенную смесь низкомолекулярных пептидов (< 10 кДа), которые высвобождаются при разрушении лейкоцитов периферической крови доноров.

Способность «Трансфер-фактора» модулировать иммунные реакции сопряжена с его способностью, во-первых, выступать в роли иммунного активатора. Так, неиммунные популяции лейкоцитов, находящиеся под влиянием TF, приобретают улучшенную способность реагировать на специфические антигены за счет усиления выработки гамма-интерферона (IFN-γ), интерлейкина IL-2, IL-17 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) CD4+ Т-клетками. Поэтому против целевого антигена развивается улучшенный клеточно-опосредованный иммунный ответ. Кроме этого, «Трансфер-фактор» является усилителем каппа-легкой цепи активированных B-клеток (NF-κB) и дифференциально регулирует продукцию TNF-α, IL-6 и IL-8 лейкоцитами, активированными бактериальными компонентами. Во-вторых, «Трансфер-фактор», как иммунный супрессор, поддерживает баланс иммунной системы, предотвращая ее гиперактивность при отсутствии новых угроз.

Компоненты-супрессоры TF участвуют в регуляции иммунного ответа на антиген путем модуляции продукции IL-10. «Трансфер-фактор» в организме животных проявляет гемопоэтическую активность, бактерицидные и бактериостатические свойства.

Совокупность биологических эффектов «Трансфер-фактора» определяет возможность его использования в качестве иммуномодулятора в схемах лечения широкого спектра заболеваний. По данным, специфический антиген «Трансфер-фактор» существует для большинства (если не для всех) антигенов. Он относится к числу механизмов, с помощью которых может быть достигнута передача иммунологической памяти от одного поколения к другому для усиления иммунного ответа.

Однако точная природа «Трансфер-фактора» до сих пор неизвестна, что определяет необходимость определения его фармакокинетики и дозировки в зависимости от способа введения в каждом конкретном случае (потенциальное клиническое применение при определенной патологии). Согласно данным, доклинические исследования позволяют выявить переменные, влияющие на биологию и функцию лимфоцитов и эффективность иммунного препарата. При этом доклиническое тестирование является необходимым условием для последующих клинических испытаний.

Эффективность и безопасность «Трансфер-фактора» (диализируемого экстракта лейкоцитов) зависит от выбора целевого антигена. Данный аспект определяет необходимость получения информации о границах между его «защитными» и токсическими свойствами. Для оценки безопасности любых препаратов, в том числе и «Трансфер-фактора», предусмотрено проведение доклинических исследований, частью которых является определение специфических видов токсичности. Их характеристика позволяет найти баланс между эффективностью и безопасностью.

Цель работы — токсикологическая оценка безопасности специфического иммунобиостимулятора антигеннаправленного действия («Трансфер-фактора») в форме, готовой для внутримышечного применения, полученного из крови гипериммунизированных доноров, на лабораторных животных в остром эксперименте.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика препарата «Трансфер-фактор». Комплексный иммунокорректирующий препарат, полученный современными биотехнологическими методами из крови крупного рогатого скота, вакцинированного против респираторно-репродуктивной и цирковирусной инфекции свиней. В качестве действующего вещества содержит трансфер-факторные белки, полученные из лейкоцитов крови под влиянием специфического антигена.

Внешний вид препарата «Трансфер-фактор»: прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.

Характеристика экспериментальных животных. Протокол экспериментальных исследований был одобрен комитетом по биоэтике ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук» (УрФАНИЦ УрО РАН, г. Екатеринбург, Россия), на базе которого выполнялись исследования по договору с ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГАУ. Исследования выполнены в лаборатории иммунологии и патобиохимии Уральского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Екатеринбург, Россия), являющегося структурным подразделением ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН. При планировании и выполнении работы руководствовались рекомендациями, приведенными в учебном пособии «Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте» и Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.

Экспериментальная часть исследований, в ходе которой изучалась острая токсичность препарата «Трансфер-фактор», выполнена с использованием двух видов животных:

1) нелинейные белые мыши (n = 40);

2) нелинейные белые крысы (n = 40).

Опытные группы формировались из условно здоровых половозрелых животных, которые ранее не были беременными, не рожали и не использовались в различных испытаниях.

Возраст и масса тела грызунов на момент формирования опытных групп составляли, соответственно, у: мышей — 10–11 недель и 18–22 г; крыс — 8–10 недель и 150–160 г.

Все животные, включенные в состав опытных групп, были выдержаны в условиях 14-суточного карантина. Содержание грызунов в условиях вивария Уральского НИВИ осуществлялось в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГОСТ 33216 и ГОСТ 33215. Для кормления грызунов опытных групп использовали полнорационные гранулированные комбикорма. Они были изготовлены на АО «Богдановичский комбикормовый завод» по ГОСТ 34566. Процесс поения организован с использованием стандартных поилок, в которые поступала водопроводная вода, качество ее соответствовало ГОСТ Р 51232.

Помещения вивария, в которых содержались грызуны опытных групп, имели стандартные условия окружающей среды. Освещение было естественно-искусственное и предусматривало 12-часовой цикл света и темноты. Температурно-влажностные параметры микроклимата контролировались прибором гигрометр психрометрический ВИТ-2 (Россия). Средства измерения поверены. При этом температура воздуха колебалась от 20 до 22 °С, относительная влажности — от 50 до 60%, что соответствовало норме.

Формирование опытных групп грызунов было выполнено за 7 дней до начала эксперимента. В качестве критерия подбора животных в группу использовали массу тела, которая стандартизирована по возрасту. При этом колебания массы тела отдельных особей относительно среднего значения в группе варьировали в пределах 10%. Каждая особь в группе была маркирована.

Для контроля массы тела животных проводили индивидуальное взвешивание на весах CAS SW-10 (Южная Корея). Средства измерения поверены.

Ночь перед опытом лабораторные животные находились без корма, питьевая вода — в свободном доступе. Утром (непосредственно перед экспериментом) взвешивали животных. Препарат «Трансфер-фактор» вводили однократно в постоянной концентрации (табл. 1).

Для клинического наблюдения за лабораторными животными после введения препарата использовалась стандартная процедура, которая предусматривала регистрацию изменения в течение первых 30 мин. острого эксперимента, а далее каждый час в течение 4 часов.

По истечении данного периода наблюдений животным давали корм.

Общая длительность острого эксперимента составила 14 суток, в ходе которых один раз в сутки (в 10 ч. утра) проводили учет клинического состояния животных и регистрировали наличие случаев смертности. При этом особо обращали внимание на клинические признаки, соответствующие острому токсикозу. Их регистрация выполнялась у каждого животного опытной группы.

Особое внимание уделяли выраженности клинических признаков, времени их появления и обратимости. Учету подлежали общее состояние животных (особенно окраска слизистых оболочек) и поведенческие реакции, наличие или отсутствие аппетита, выраженность мышечной активности и состояние скелетных мышц.

Кроме этого, регистрировали реакцию животных на различные раздражители (тактильные, болевые, звуковые, световые), количество дефекаций и консистенцию фекалий.

Взвешивание животных проводили на 7-й и 14-й день эксперимента. После окончания эксперимента проводили эвтаназию мышей и крыс с соблюдением принципов гуманного отношения к животным, их аутопсию и макроскопическую оценку внутренних органов. При этом особое внимание уделяли осмотру легких, сердца, почек, селезенки, печени, кишечника и месту инъекции исследуемого препарата.

Статистическую обработку эмпирических данных проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics (США).

Результаты и обсуждение

Внедрение в ветеринарную практику современных фармакологических средств возможно лишь при наличии испытаний, в ходе которых выявлены специфика их активности и категория безопасности. Данный вид экспериментальных исследований предусматривает определение безопасности препарата для организма лабораторных животных с учетом валидации дозозависимых эффектов. При этом лабораторные грызуны относительно недороги в содержании, доступны для использования в экспериментальных моделях, и полученные данные можно экстраполировать на другие виды животных.

Определение острой токсичности предусматривает проведение токсикометрической оценки и изучение симптомокомплекса отравления при однократном поступлении специфического иммунобиостимулятора в организм лабораторных животных.

Характеристика жизненно важных признаков лабораторных животных. Тестирование на острую токсичность предусматривает определение уровня летальности животных при однократном применении препарата, что свидетельствует о категории его опасности.

При оценке острой токсичности препарата «Трансфер-фактор» не было выявлено случаев смертности среди лабораторных животных опытных групп (все животные дожили до конца 14-суточного экспериментального периода), ярких признаков острой токсичности, что в целом свидетельствовало о высоком уровне безопасности испытуемого препарата.

Регистрация жизненно важных признаков у лабораторных животных в течение первых 30 мин. после внутримышечного введения препарата «Трансфер-фактор» мышам и крысам в дозировке 0,1 мл/гол и 1,0 мл/гол, соответственно, показала, что изменения в их общем физическом состоянии отсутствовали.

Все животные опытных групп были живы и активны, пили воду в обычном режиме, слизистые оболочки глаз и ротовой полости оставались бледно-розового цвета, частота и глубина дыхательных движений соответствовали физиологической норме, координация движений и тонус скелетных мышц не нарушены, угнетенного состояния не отмечали.

Цвет фекалий и консистенция соответствовали физиологической норме.

Однако после введения препарата «Трансфер-фактор» мышам внутримышечно (0,25 мл/гол) и внутрибрюшинно (0,5 мл/гол), крысам внутримышечно (2,5 мл/гол) и внутрибрюшинно (2,5 мл/гол) наблюдался тремор мышц, исчезающий через 15–20 мин. При внутрибрюшинном введении мышам и крысам в дозировках 0,75 мл/гол и 3,75 мл/гол, соответственно, продолжительность тремора достигала 40 мин. Следовательно, однократное введение препарата в относительно высокой дозе лабораторным животным характеризовалось острым нейротоксическим эффектом, что, по данным, является следствием физиологических и биохимических изменений в нервной системе. При этом введение препарата не сопровождалось формированием дегенеративных сдвигов в нейроцелюлярных элементах, так как нейротоксический эффект имел обратимый характер.

Кратковременное периферическое нейротоксическое действие «Трансфер-фактора», возможно, связано с нарушением проведения нервных импульсов по двигательным волокнам мышечной ткани, сопряженным со скоростью всасывания препарата.

Через час после введения препарата «Трансфер-фактор» во всех дозировках в опытных группах животных не было выявлено летальных случаев. Однако наблюдалось снижение двигательной активности в условиях сохранения нормального потребления корма и воды. Следовательно, «двигательная заторможенность» не сопровождалось дефицитом пространственной ориентации животных, позволяя сохранять жизненно важные поведенческие функции. Это можно отнести к кратковременной реакции организма лабораторных животных на введенный препарат.

Через 2 ч. после введения «Трансфер-фактора» лабораторным животным (независимо от дозировки и способа введения) в опытных группах все особи были живы. При этом восстановилась их двигательная активность до физиологического состояния, цвет фекалий и консистенция соответствовали норме.

В контрольных точках наблюдения за грызунами (через 3 и 4 часа) после введения исследуемого препарата не отмечалось отрицательной динамики в их состоянии, отсутствовали и случаи смертности особей в опытных группах.

В течение последующего 14-суточного периода клинического наблюдения у животных опытных групп не были зарегистрированы признаки токсикоза и гибели. При этом отсутствовали отклонения в поведенческой и двигательной активности.

Таким образом, внутримышечное и внутрибрюшинное одноразовое введение «Трансфер-фактора» нелинейным мышам и крысам не привело к смерти животных и появлению существенных токсических симптомов, за исключением кратковременного нейротоксического эффекта. При этом все животные характеризовались нормальным поведением и выжили до конца 14-суточного периода наблюдений.

Изменение массы тела. Оценка острой токсичности «Трансфер-фактора» с использованием фиксированных доз предусматривала контроль за массой лабораторных животных, которая является интегральным показателем состояния их организма в соответствующем возрасте. Ее изменчивость напрямую сопряжена с уровнем потребления корма, являющимся «ключевым параметром» здорового организма.

Результаты наблюдения за живой массой лабораторных животных в течение эксперимента представлены в таблицах 2, 3.

При первичном взвешивании мышей перед введением исследуемого препарата особи опытных групп практически не имели различий по массе тела, которая варьировала в интервале 17,82 ± 1,32 — 18,22 ± 1,15 г. Взвешивание мышей в контрольные точки опыта «через 7 дней» и «через 14 дней» показало, что она планомерно увеличивалась на 10,15–14,25%, свидетельствуя о росте и развитии особей в стандартизированных условиях кормления. Следовательно, введение препарата «Трансфер-фактор» не оказало влияния на уровень здоровья экспериментальных животных, так как не отразилось на их пищевом поведении и количестве потребляемого корма.

Тестирование острой токсичности «Трансфер-фактора» по изменению массы тела крыс показало, что она планомерно увеличивалась в ходе 14-суточного периода наблюдений (табл. 3). При этом в контрольной точке опыта «через 14 дней» по сравнению с данными первичного взвешивания» ее прирост составил 11,84–17,67%, что, по данным, свидетельствует об отсутствии неблагоприятного воздействия исследуемого препарата на организм животных.

Таким образом, изменчивость массы тела лабораторных животных после однократного внутримышечного (внутрибрюшинного) введения препарата «Трансфер-фактор» в различных дозировках указывает на то, что он не оказал негативного воздействия на рост животных.

Макроскопическое исследование внутренних органов. Макроскопическая оценка внутренних органов лабораторных животных, подвергнутых эвтаназии через 14 дней наблюдения, показала, что видимые изменения в расположении органов, жидкость в брюшной и плевральной полостях отсутствовали. Однако установлены некоторые патологические изменения цвета, консистенции и размера внутренних органов (табл. 4).

Согласно данным, макроскопические изменения во внутренних органах животных отражают направленность и динамику обменных процессов в их организме. Поэтому изменения, выявленные во внутренних органах лабораторных мышей и крыс после однократного введения препарата «Трансфер-фактор» в высоких дозировках, являются следствием запуска адаптационно-компенсаторных сдвигов в их организме, сопровождающихся изменением метаболического статуса клеток легких, сердца, печени и селезенки, функционирование которых прямо или косвенно сопряжено с функционированием иммунной системы.

Выводы

Таким образом, исследование острой токсичности препарата «Трансфер-фактор» показывает, что после его введения мышам внутримышечно (0,25 мл/гол) и внутрибрюшинно (0,5 мл/гол), крысам внутримышечно (2,5 мл/гол) и внутрибрюшинно (2,5 мл/гол) наблюдается тремор мышц, исчезающий через 15–20 минут.

При внутрибрюшинном введении препарата мышам и крысам в дозировках 0,75 мл/гол и 3,75 мл/гол, соответственно, продолжительность тремора достигает 40 мин. В ходе 14-суточного периода наблюдений масса тела мышей и крыс увеличивается на 10,15–14,25% и 11,84–17,67%, свидетельствуя об отсутствии негативного воздействия препарата на рост животных.

При аутопсии животных после 14-суточного наблюдения видимых изменений в расположении органов не выявлено, жидкость в брюшной и плевральной полостях отсутствует. Однако установлены некоторые патологические изменения цвета, консистенции и размера внутренних органов (легких, сердца, селезенки, печени): у мышей и крыс при внутримышечном введении «Трансфер-фактора» в дозировке 0,25 мл/гол и 2,5 мл/гол, внутрибрюшинном введении мышам в дозировке 0,5 мл/гол и 0,75 мл/гол, крысам — 2,5 мл/гол и 3,75 мл/гол.

Отсутствие гибели лабораторных животных при однократном введении препарата «Трансфер-фактор» в исследуемых дозировках позволяет сделать вывод о том, что он не обладает острой токсичностью и в соответствии с ГОСТ 12.1.007 может быть отнесен к IV классу опасности «Вещества малоопасные». В связи с этим «Трансфер-фактор» является перспективным препаратом в профилактике цирковирусных заболеваний свиней.

Об авторах

Павел Валерьевич Бурков1; кандидат ветеринарных наук, руководитель научно-исследовательского центра биотехнологии репродукции животных

burcovpavel@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7515-5670

Марина Аркадьевна Дерхо1; доктор биологических наук, заведующая кафедрой естественно-научных дисциплин

derkho2010@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-3818-0556

Максим Борисович Ребезов2, 3; доктор сельскохозяйственных наук, кандидат ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник2;доктор сельскохозяйственных наук, кандидат ветеринарных наук, профессор кафедры биотехнологии и пищевых продуктов3

rebezov@ya.ru; https://orcid.org/0000-0003-0857-5143

Павел Николаевич Щербаков1; доктор ветеринарных наук, профессор кафедры инфекционных болезней и ветеринарно-санитарной экспертизы

scherbakov_pavel@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8685-4645

Арина Олеговна Дерхо1; студент

arina_avrora@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1914-8721

1Южно-Уральский государственный аграрный университет, ул. им. Гагарина, 13, Троицк, Челябинская обл., 457100, Россия

2Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова Российской академии наук, ул. им. Талалихина, 26, Москва, 109316, Россия

3Уральский государственный аграрный университет,  ул. им. Карла Либкнехта, 42, Екатеринбург, 620075, Россия

УДК 619:616.98:578-08
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-386-9-40-47

Просмотров: 71