Результативность получения ооцитов при проведении повторной серии трансвагинальной УЗИ-ассистированной пункции фолликулов у телок симментальской породы

Получение эмбрионов методом экстракорпорального оплодотворения (IVP-эмбрионы) является доминирующей технологией в коммерческом производстве эмбрионов крупного рогатого скота — начиная с 2015 года. Основной метод получения ооцитов для производства IVP-эмбрионов — УЗИ-ассистированная трансвагинальная пункция фолликулов (OPU).

Повышение эффективности использования коров-доноров для получения OPU-ооцитов требует оптимизации режимов их использования в отношении количественных и качественных характеристик получаемых ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) и их компетенций к развитию. Временные режимы использования доноров, способные оказывать влияние на результативность OPU за определенный период и в расчете на один сеанс, включают кратность проведения сеансов OPU, продолжительность серии (число сеансов OPU в серии), период отдыха между сериями OPU, срок использования доноров.

Так, проведение сеансов OPU в режиме дважды в неделю на пакистанской локальной породе коров Сахивал по сравнению с проведением OPU один раз в неделею или один раз в две недели способствовало увеличению числа фолликулов среднего размера, обусловливая повышение доли ооцитов хорошего качества, а также регулировало связанные с ооцитами паракринные факторы, приводя к более высокой степени ядерного созревания и улучшению развития эмбрионов in vitro.

В данных исследованиях, проведенных на тёлках-донорах симментальской породы, достоверно большее число визуализированных фолликулов наблюдалось при проведении аспирации фолликулов с интервалом 3 дня: 15,9 фолликулов за сеанс, что было, соответственно, на 5,4 и 5,1 фолликулов больше по сравнению с использованием интервала 4 и 7 дней, при этом различий в качестве ОКК между группами выявлено не было.

В исследованиях, проведенных на коровах породы Ханву, было установлено, что увеличение периода отдыха между сериями, каждая из которых включала 13 последовательных сеансов OPU, с 2 до 3 месяцев обусловливало тенденцию повышения степени извлечения ооцитов с 64,6 до 70,9%, а также достоверное снижение доли дегенерированных ооцитов с 36,5 до 27,3%. На этой же породе коров была изучена результативность OPU при продолжительном использовании доноров в течение 3–4 месяцев в год с интенсивностью дважды в неделю в течение трех лет.

Были показаны поступательное увеличение числа визуализированных фолликулов и полученных ОКК, достоверное снижение доли дегенерированных ооцитов с 14,2% и 12,2% до 8,5% с 1-го по 3-й год использования доноров. Оценка общей результативности показала достоверное снижение среднего числа полученных эмбрионов за сеанс во второй год использования доноров по сравнению с первым (3,29 против 3,89), однако на 3-й год достоверные различия не наблюдались (3,51 эмбриона).

Цель данной работы — сравнительная оценка результативности трансвагинального УЗИ-ассистированного получения ооцитов при проведении двух последовательных серий OPU у телок-доноров симментальской породы.

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проводили в ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (Московская обл., Россия.) на тёлках-донорах симментальской породы (n = 7) в возрасте от 3 лет 4 мес. до 3 лет 5 мес. на дату начала проведения эксперимента (июль — сентябрь 2022 г.).

Эксперименты с животными проводились в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Протоколы с использованием животных были одобрены Комиссией ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста по биоэтике, протокол  от 18 января 2021 г. № 2.

В дневной период животные содержались на пастбище, в ночной — беспривязно одной группой под навесом. Дополнительно животные получали комбикорм в соответствии с нормами потребностей.

Перед началом эксперимента и непосредственно перед проведением каждого сеанса OPU проводили клинический осмотр животных в соответствии с общепринятыми методами. Схема эксперимента представлена на рисунке 1.

Как показано на рисунке 1, в ходе проведения эксперимента на каждом из доноров были выполнены две серии OPU, каждая из которых включала пять последовательных сеансов с периодичностью один раз в неделю. Период отдыха между сериями — 14 дней.

Аспирацию фолликулов выполняли с использованием системы для проведения OPU у крупного рогатого скота (Minitube, Германия), в комплект которой входят ультразвуковой сканер, секторный УЗИ-зонд Aloka UST-9111-5 (Fujifilm, Япония), 5 МГц/90/14 мм с держателем и вакуумный насос. Проведение OPU осуществляли по ранее описанной методике.

Аспирации подвергали все УЗИ-видимые фолликулы с диаметром более 2 мм. Оценку качества полученных ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) проводили по морфологическим критериям на основании числа и целостности слоев кумулюса, прозрачности и гомогенности цитоплазмы.

Ооциты с гомогенной цитоплазмой и наличием одного и более слоев компактного кумулюса относили к ОКК хорошего качества, с гомогенной цитоплазмой и неполным слоем или отсутствием кумулюса — к ОКК удовлетворительного качества (условно нормальным), с неоднородной цитоплазмой с признаками грануляции или лизиса — к дегенерированным ОКК.

Статистическую обработку полученных цифровых данных выполняли на персональном компьютере с использованием MS Excel (США). Оценку степени достоверности различий между группами проводили на основании непараметрического критерия Манна — Уитни (U-критерий) для двух независимых выборок. В качестве нижнего порога значимости выявленных различий был выбран уровень достоверности p < 0,05. Для лучшей интерпретации полученных результатов наряду со средними значениями рассчитывали значения стандартных ошибок.

Результаты и обсуждение

Ультразвуковые исследования яичников показали, что у шести из семи опытных животных суммарное число УЗИ-видимых фолликулов за пять последовательных сеансов проведения OPU в 1-й серии превышало значения показателя, наблюдаемые при проведении повторной серии. Значения данного показателя у отдельных доноров в 1-й серии варьировали от 24 до 49, во 2-й серии — от 21 до 32. В среднем от каждого донора за серию было получено, соответственно, 35,1 ± 0,5 и 26,7 ± 0,4 фолликулов (рис. 2).

При проведении повторной серии у телок-доноров в среднем за сеанс были визуализированы на 1,7 фолликулов меньше по сравнению со значением данного показателя, установленным в первой серии (7,0 против 5,3 фолликулов, p < 0,05).

Различия между сериями у отдельных доноров имели характер тенденции, что может быть вызвано высокой вариабельностью показателя между отдельными сеансами OPU у одних и тех же доноров: Cv = 15,1–64,9% и 23,9–60,9% в 1-й и 2-й сериях соответственно (табл. 1).

В повторной серии OPU наблюдалась тенденция более высокой степени извлечения ооцитов по сравнению с первой серией (49,4% против 43,9%). Следует отметить, что выявленные различия были обусловлены главным образом заметно меньшими значениями данного показателя при проведении первого сеанса OPU в 1-й серии: 23,8% против 45,5–55,8% при проведении четырех последующих сеансов в этой серии.

Такие различия в показателях могут быть обусловлены тем, что при проведении первого сеанса OPU животные находились на случайных стадиях полового цикла, в результате чего у некоторых из них процедура OPU проводилась на менее оптимальных стадиях для извлечения ОКК. Во 2-й серии различия в степени извлечения ооцитов между сеансами имели менее выраженный характер — 40,0–64,0%.

Не наблюдалась однонаправленная зависимость в числе полученных ОКК у отдельных животных-доноров между сериями OPU: у трех животных большее число ОКК было получено в 1-й серии, у трех — во 2-й, а у одного животного различий по данному показателю между сериями выявлено не было.

Суммарное число ОКК, полученных от одного донора, в 1-й серии варьировало от 7 до 22 и в среднем составило 15,4 ± 0,4 ОКК, в то время как во 2-й серии — от 8 до 21 со средним значением показателя 13,7 ± 0,3 ОКК (рис. 3).

При проведении повторной серии от одного донора в среднем за сеанс были получены на 0,4 ОКК меньше (3,1 против 2,7 ОКК), однако выявленные различия носили характер тенденции (табл. 2).

Результаты сравнительного анализа паттерна яичников и числа полученных ОКК при проведении различных сеансов OPU между сериями показаны на рисунке 4.

Как показано на рисунке 3, была выявлена тенденция снижения числа УЗИ-видимых фолликулов при проведении повторной серии во всех пяти сеансах, при этом наибольшие различия между сериями отмечались в первом сеансе. Интересно, что при проведении первого сеанса OPU в 1-й серии наблюдалось заметно большее число фолликулов по сравнению со всеми последующими сеансами в этой серии (9,0 против 6,1–7,3 фолликулов).

Как уже отмечалось выше, такие различия могут быть обусловлены нахождением животных при проведении первого сеанса на различных стадиях полового цикла. В пользу данного предположения свидетельствуют наиболее высокие значения коэффициента вариации среднего числа фолликулов у отдельных животных в первом сеансе OPU: Cv = 68,1% против 50,0%, 67,4%, 49,7% и 40,1% (во втором — пятом сеансах соответственно).

При проведении первого сеанса в повторной серии, напротив, было визуализировано существенно меньше УЗИ-видимых фолликулов по сравнению с последующими сеансами (3,6 против 5,6–6,1 фолликулов). Известно, что в процессе полового цикла у молочных коров в большинстве случаев наблюдается две или три волны роста фолликулов, при этом начало второй волны происходит, соответственно, на 10,7-й и 7-й день, а третьей волны — на 14-й день.

Таким образом, с учетом продолжительности периода отдыха между сериями 14 дней у части коров-доноров с трехволновым половым циклом при проведении повторной серии первый сеанс OPU мог приходиться на самое начало второй волны роста фолликулов, когда фолликулы новой когорты имеют маленький размер и плохо визуализируются посредством УЗИ, а часть фолликулов первой волны уже подверглась атрезии.

Заметных различий в числе полученных ОКК в отдельных сеансах между сериями OPU выявлено не было, за исключением четвертого сеанса, в котором в первом сеансе были получены на 1,1 ОКК больше по сравнению с значением показателя при проведении повторной серии (3,4 против 2,3 ОКК) (рис. 4).

Анализ распределения полученных ОКК по качеству не выявил заметного ухудшения качества ОКК, полученных при проведении повторной серии OPU по сравнению с 1-й серией: доля ОКК хорошего и удовлетворительного качества, пригодных для дальнейшего использования, между сериями практически не различалась: 67,0% против 63,5%, при этом в отдельных сеансах OPU различия между сериями имели разнонаправленный характер (рис. 5).

Оценка компетенций ооцитов к дальнейшему развитию в системе in vitro показала отсутствие достоверных различий в степени созревания ооцитов, полученных в двух сравниваемых сериях. Оплодотворение и дальнейшее культивирование показали достоверно более высокую степень первого деления — дробления при проведении 1-й серии OPU (p < 0,05), однако данные различия нивелировались при дальнейшем культивировании. Достоверных различий в выходе бластоцист между сериями OPU выявлено не было: 23,6% против 21,7% (табл. 3).

Таким образом, проведение повторной серии, включающей пять сеансов трансвагинальной УЗИ-ассистированной пункции фолликулов, после двухнедельного периода покоя обеспечивает возможность получения ооцитов у телок-доноров симментальской породы без существенной потери результативности, на что указывает отсутствие достоверных различий между сериями в количественных характеристиках получаемых ооцитов, их компетенциях к дальнейшему развитию в системе in vitro.

Выводы

Проведенные сравнительные исследования результативности трансвагинального УЗИ-ассистированного получения ооцитов при проведении двух последовательных серий OPU у телок-доноров симментальской породы не выявили достоверных различий между сериями в количественных характеристиках ооцитов, компетенциях OPU-ооцитов к дальнейшему развитию в системе in vitro. В связи с этим проведение повторной серии OPU после двухнедельного перерыва может быть рекомендовано для получения ооцитов у телок-доноров симментальской породы.

Об авторах

Роман Юрьевич Чинаров; кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии

roman_chinarov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6511-5341

Тел.+7 (915) 240-44-11

Виктория Александровна Луканина; кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии

kristybatle@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-4744-7873

Галина Николаевна Сингина; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии

g_singina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0198-9757

Екатерина Николаевна Шедова; научный сотрудниклаборатории экспериментальной эмбриологии

shedvek@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9642-2384

Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольск, Московская обл., 142132 Россия

УДК 636.082
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-386-9-65-70

Просмотров: 100